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酶标仪

酶标仪简单的是用滤光方式来划分。一般来说,可以分为滤光片型和光栅型两大类。也有一些酶标仪里面同时装上了滤光片和光栅。但是滤片和光栅并不能同时完成同一个检测,本质上还只是把滤片和光栅放在了一起,并没有使两者糅合而产生新的技术突破。

滤光系统

酶标仪简单的是用滤光方式来划分。一般来说,可以分为滤光片型和光栅型两大类。也有一些酶标仪里面同时装上了滤光片和光栅。但是滤片和光栅并不能同时完成同一个检测,本质上还只是把滤片和光栅放在了一起,并没有使两者糅合而产生新的技术突破。

光栅型滤光系统具有使用方便,可以进行光谱扫描,灵活性等优点。当然,滤光片系统也有其显著的优势,例如价格较为便宜,检测灵敏度高,带宽的可选择性,可以进行快速的滤光片切换,可配备有自动加样系统,在化学发光检测中光线的透过率高。

目前,滤光片系统应用更广,因为它可以让实验者完成更多的试验。

测定波长

一般酶标仪的测定波长在400~750nm或800nm之间,完全可以满足ELISA的显色测定。目前国内常见的ELISA试剂盒所使用的标记用酶均为辣根过氧化物酶(HRP),底物通常为四甲基联苯胺(TMB)和邻苯二胺(OPD),其在过氧化氢溶液的存在下,经HRP作用,分别氧化为2,2,—二氨基偶氮苯(DAB)和联苯醌。当pH值为5.0左右时,DAB在450nm波长处有吸收,当pH值降为L 0时,吸收波长移至492 nm,同时摩尔消光系数变大,显色加深,因而常用强酸如硫酸或盐酸终止反应。TMB的氧化产物联苯醌在波长450nm处有消光系数,如果HRP量少,H:O:和TMB过量时,则形成蓝色的阳离子根。降低pH,即可使蓝色的阳离子根转变为黄色的联苯醌,使用硫酸作为终止剂可使产物稳定90min。因此,450nm和492 nm两个波长是目前ELISA测定常用的。各种酶标仪都配有放置滤光片的可自动转换的部件,可以同时安装6~8片滤光片,所配备的滤光片均应包括上述两个波长,有的酶标仪以490nm滤光片替代492nm滤光片,影响不大。除了这两个基本滤光片外,考虑到双波长比色的需要,还应有620nm或630nm或650nm和405nm波长的滤光片,其他滤光片可根据自己的需要选择。有时,有的实验室希望用酶标仪作微量生化测定,故酶标仪生产厂家对其生产的酶标仪扩展了紫外检测功能,此时需要一个340 nm波长滤光片。此时,酶标仪的测定波长范围就成为340—750nm或800nm。

酶标仪有单波长和双波长检测功能。有时使用者不知在什么情况下使用单或双波长检测。所谓的“单波长”就是使用一种对显色具吸收的波长即450 nm或492 nm进行比色测定;而“双波长”则除了用对显色具吸收的波长即450 nm或492 nm进行比色测定外,同时用对特异显色不敏感的波长如630 nm进行测定,酶标仪打印出来的吸光度则为二者之差。630 nm波长下得到的吸光度是非特异的,来自于板孔上诸如指纹、灰尘、脏物等所致的吸收。因此,在ELISA比色测定中,使用双波长,且不必设空白孔。

测定的吸光度范围

通常,酶标仪的吸光度测定范围在0~2.5之间即可以满足ELISA的测定要求。早期的酶标仪可测定的吸光度一般在0~2.5之间,但现在基本上都做了拓宽,可达到3.5以上,并且能保持很好的精密度与线性。因此,对于酶标仪的吸光度范围不必去刻意追求大的吸光度范围,主要要看在一定的吸光度范围内的线性和精密度如何。

光学系统

酶标仪的光学系统采用的是垂直光路多通道(通常为8或12通道,亦有单通道)检测,一般为硅光管或光导纤维,除测定通道外,有的酶标仪还有一个参比通道,每次测定可进行自我校准。酶标仪的光学系统功能如何,均可通过酶标仪测定的吸光度范围、线性度、精密度和准确度等体现出来。光学系统好的话,则上述指标也应较佳。测定的精密度与测定通道之间的均一性有直接关系。单通道可避免因通道不同所致的差异。

检测速度

酶标仪的检测速度是指其完成比色测定所需要的时间。检测速度快,有利于提高检测的精密度,即避免由于测定过程中,因测定时间不同所致的各微孔间吸光度间的差异。目前市场上常见的酶标仪检测速度都非常快,通常在数秒钟内。